免费DNA浓度计算器

引言

DNA定量计算器（也称为A260计算器、核酸浓度计算器或DNA吸光度计算器）是一款免费在线工具，利用紫外吸收数据简化DNA、RNA和寡核苷酸样品的定量。它同时作为DNA和RNA浓度计算器，根据样品类型自动应用正确的换算系数。研究人员只需输入260 nm处的吸光度、选择样品类型，并可选提供稀释因子和光程，即可获得以µg/mL为单位的浓度。对于寡核苷酸，该工具接受序列并在内部计算分子量和摩尔消光系数。

为什么核酸定量很重要

在进行任何敏感的分子生物学实验（PCR、qPCR、测序、克隆或逆转录）之前，必须知道核酸样品的精确浓度和纯度。高估或低估都可能导致反应效率低下或浪费试剂。因此，定量是提取或纯化后的常规步骤。

常用定量方法

1. 紫外分光光度法 – 测量样品在260 nm处的吸光度。它快速、无需额外试剂，并能通过吸光度比值提供纯度信息。但无法区分DNA和RNA，在低浓度下灵敏度有限。
2. 荧光染料结合法 – 使用仅在结合核酸时才会发出荧光的染料。它具有更高的灵敏度和特异性，但需要标准曲线和额外操作。
3. 琼脂糖凝胶电泳 – 通过将条带强度与已知标准品进行比较，目测评估浓度和完整性。该方法劳动强度大且仅是半定量。

本文描述的DNA浓度计算器专注于第一种方法，该方法仍是常规定量中最广泛使用的。

从A₂₆₀计算浓度

紫外吸光度与核酸浓度之间的关系遵循比尔-朗伯定律。对于标准样品，浓度 $C$（单位：µg/mL）由下式给出：

$$C = \frac{A_{260} \times \text{Dilution Factor}}{l \times \text{Conversion Factor}}$$

其中：

• $A_{260}$ 是260 nm处的吸光度读数（对于大多数仪器无量纲）。
• $l$ 是比色皿的光程，通常为1 cm。
• 稀释因子（DF） 表示原始样品的任何稀释（未稀释时DF = 1）。
• 换算因子（CF） 是取决于核酸类型的固定常数。

标准换算因子（对于1 cm光程）如下：

样品类型	CF（µg/mL 每 A₂₆₀ 单位）
dsDNA	50
ssDNA	33
RNA	40

如果仪器使用不同的光程，结果会线性缩放。该工具允许您选择样品类型，从而自动应用正确的换算因子。

通过吸光度比值评估纯度

除浓度外，紫外分光光度法还可以指示样品纯度。常用比值 $A_{260}/A_{280}$：

• 值接近 1.8 被认为是纯DNA。
• 值约为 2.0 表示纯RNA。
• 较低的值表明存在蛋白质或其他物质的污染。

$A_{260}/A_{230}$ 比值（通常 >2.0）可以揭示有机化合物或离液盐的污染。

寡核苷酸序列的浓度

由于合成寡核苷酸较短且具有依赖碱基的摩尔消光系数，上述简单换算因子不准确。取而代之，浓度使用序列特异性分子量（MW）和260 nm处的摩尔消光系数（$\varepsilon_{260}$）计算：

$$C \ (\text{µg/mL}) = \frac{A_{260} \times DF \times MW}{l \times \varepsilon_{260}}$$

确定分子量

寡核苷酸的分子量是其各个核苷酸平均原子量的总和，并针对末端基团进行校正。每个核苷酸的重量（单位：道尔顿，1 Da ≈ 1 g/mol）如下：

核苷酸	ssDNA (Da)	dsDNA (Da)	RNA (Da)
腺嘌呤	313.21	616.78	329.21
鸟嘌呤	329.21	617.88	345.21
胞嘧啶	289.18	617.88	305.18
胸腺嘧啶	304.20	616.78	—
尿嘧啶	—	—	306.20

末端校正：

• 未修饰ssDNA（无5′-磷酸）：减去61.96 Da。
• 含5′-单磷酸的ssDNA：加上17.04 Da。
• 无5′-磷酸的dsDNA：减去123.38 Da。
• 含5′-磷酸的dsDNA：加上34.08 Da。
• 含5′-三磷酸的RNA：加上159.0 Da。

通过最近邻模型计算摩尔消光系数

260 nm处的摩尔消光系数不仅取决于碱基组成，还取决于序列顺序。推荐的方法是最近邻模型，该模型考虑了碱基堆积相互作用：

$$\varepsilon_{260} = \sum_{i=1}^{N-1} \varepsilon_{\text{pair}}^{(i)} - \sum_{i=2}^{N-1} \varepsilon_{\text{base}}^{(i)}$$

第一个求和是对长度为 $N$ 的序列中所有相邻碱基对；第二个求和覆盖内部碱基（不包括第一个和最后一个）。相应的系数值（×10³ M⁻¹ cm⁻¹）如下：

最近邻摩尔消光系数（×10³ M⁻¹ cm⁻¹）

5′\3′	A	G	C	T	U
A	27.4	25.0	21.2	22.8	24.6
G	25.2	21.6	17.6	20.0	—
C	21.2	18.0	14.6	15.2	17.2
T	23.4	19.0	16.2	16.8	—
U	24.0	21.2	16.2	—	19.6

单个碱基摩尔消光系数（×10³ M⁻¹ cm⁻¹）

A	G	C	T	U
15.4	11.5	7.4	8.7	9.9

工作示例

取未修饰的ssDNA序列 AGGTC（N = 5）。

1. 分子量：
   每个核苷酸重量之和：313.21（A）+ 329.21（G）+ 329.21（G）+ 304.20（T）+ 289.18（C）= 1565.01 Da。
   减去未修饰ssDNA的校正值（61.96 Da）→ 1503.05 Da（≈ 1503.05 g/mol）。

2. 摩尔消光系数：
   最近邻对：AG、GG、GT、TC。
   对ε之和：25,000 + 21,600 + 20,000 + 15,200 = 81,800 M⁻¹ cm⁻¹。
   内部碱基（位置2-4）：G、G、T → 单个ε之和 = 11,500 + 11,500 + 8,700 = 31,700 M⁻¹ cm⁻¹。
   ε₂₆₀ = 81,800 − 31,700 = 50,100 M⁻¹ cm⁻¹。

3. 浓度计算：
   当A₂₆₀读数为4.900、光程1 cm、无稀释时，计算器应用寡核苷酸公式并返回浓度 ≈ 149 µg/mL（0.149 g/L）。该值在合成寡核苷酸的典型范围内。

该工具自动执行所有这些步骤，使您可以专注于实验计划而非手动计算。